作者：石恩慧 郭凱軍 李紅 谷明燦 魯琳 賈昌喜 單位：北京農學院食品科學與工程學院 農產品有害微生物及農殘安全檢測與控制北京市重點實驗室 北京農學院動物科學與技術學院

１材料與方法

１．１材料與主要試劑板栗總苞（采自北京市懷柔區板栗實驗站）：用粉碎機將板栗殼粉碎并過８０目篩，－１８℃避光保存備用。主要試劑：福林－酚（ＦＣ）試劑、沒食子酸標準品（含量＞９８％）和ＤＰＰＨ購于Ｓｉｇｍａ公司；ＡＢＴＳ購于東京化成工業株式會社；維生素Ｃ和維生素Ｅ購于北京奧博星生物技術有限責任公司。

１．２板栗總苞多酚提取工藝流程干燥板栗總苞粉碎溶劑與物料混合不同條件下水浴提取（每個樣提取２次）混合２次提取液離心濃縮板栗總苞多酚提取液冷凍干燥提取物粉末。

１．３板栗總苞多酚提取條件的研究

１．３．１單因素試驗設計稱取１０ｇ板栗總苞，用乙醇濃度為６０％，液料比為２０∶１（ｍＬ∶ｇ），提取溫度為６０℃，提取時間為１２０ｍｉｎ作為進行單因素篩選試驗的基礎條件。當研究某一因素時，其他條件保持不變。乙醇濃度分別選用２０％、３０％、４０％、５０％、６０％和７０％；液料比（ｍＬ∶ｇ）分別選用１５∶１、２０∶１、２５∶１、３０∶１和３５∶１；提取時間分別選用４０、８０、１２０、１６０和２００ｍｉｎ；提取溫度分別選用５０、６０、７０、８０和９０℃，按上述設計分別進行單因素不同水平的選擇試驗，得到的提取物按照標準曲線處理方法，測定在７６５ｎｍ波長處的吸光度，并計算轉換為板栗總苞多酚提取得率，以此比較提取效果。

１．３．２正交試驗設計為了綜合考慮各因素對板栗總苞多酚提取得率的影響，根據１．３．１中單因素試驗結果，選取乙醇濃度、液料比、提取時間和提取溫度為４個考察因素，利用ＳＰＳＳ１６．０設計四因素四水平［Ｌ１６（４４）］正交試驗，試驗因素水平見表１。

１．３．３板栗總苞多酚的測定

１．３．３．１沒食子酸標準曲線的制作準確稱取５ｍｇ沒食子酸標準品于５０ｍＬ容量瓶中，定容至刻度，配成０．１ｍｇ／ｍＬ的標準液，分別吸取０．５、１．０、１．５、２．０和２．５ｍＬ沒食子酸標準液（０．１ｍｇ／ｍＬ）并定容至１０ｍＬ，配制成質量濃度為０．００５、０．０１０、０．０１５、０．０２０、０．０２５ｍｇ／ｍＬ的標準溶液。精確吸取上述標準溶液０．４ｍＬ于１０ｍＬ離心管中，加入０．２ｍｏｌ／ＬＦＣ試劑１ｍＬ、１５％Ｎａ２ＣＯ３溶液２ｍＬ，蒸餾水定容至８ｍＬ，２５℃反應２ｈ。另精確吸取蒸餾水０．４ｍＬ，同法操作作為空白對照。在７６５ｎｍ波長處測量其吸光度。繪制吸光度與濃度的標準曲線（圖１），并擬合線性回歸方程。所得標準曲線的線性回歸方程為：Ｙ＝４．３２３Ｘ＋０．０１６６（Ｒ２＝０．９９９８）。式中：Ｙ為吸光度；Ｘ為沒食子酸標準品濃度（ｍｇ／ｍＬ）。標準曲線表明，沒食子酸在濃度為０．００５～０．０３０ｍｇ／ｍＬ區間有良好的線性關系。

１．３．３．２板栗總苞多酚提取得率、多酚含量計算按照以下公式計算板栗總苞多酚提取得率、多酚含量：提取得率（％）＝提取物質量／原材料質量×１００；多酚含量（％）＝提取多酚質量／提取物質量×１００。

１．４板栗總苞多酚體外抗氧化試驗

１．４．１樣品處理板栗總苞多酚和維生素Ｃ母液的配制：分別精確稱取０．５ｇ板栗總苞多酚和維生素Ｃ粉末放于燒杯中，加蒸餾水溶解，將此溶液轉移到５００ｍＬ的容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，配成終濃度為１ｍｇ／ｍＬ的母液；維生素Ｅ母液的配制：精確稱取０．５ｇ維生素Ｅ粉末于燒杯中，加體積比為１０％的乙醇水溶液２０ｍＬ，振蕩使之溶解，轉移到５００ｍＬ容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，配成終濃度為１ｍｇ／ｍＬ的母液。

１．４．２ＤＰＰＨ•清除率測定參考Ｌｕｏ等［１８］的方法，同時作適當修改。取板栗總苞多酚、維生素Ｃ和維生素Ｅ母液，分別稀釋成不同濃度（０．０２５、０．０５０、０．０７５、０．１００、０．１２５、０．１５０、０．１７５和０．２００ｍｇ／ｍＬ）的溶液。吸取不同濃度的板栗總苞多酚、維生素Ｃ和維生素Ｅ溶液２．０ｍＬ，加入２．０ｍＬＤＰＰＨ•溶液（０．２ｍｍｏｌ／Ｌ），搖勻，避光放置３０ｍｉｎ。以無水乙醇調零，測定５１７ｎｍ波長處的吸光度（Ａ樣）；分別測定２．０ｍＬ不同濃度的板栗總苞多酚、維生素Ｃ和維生素Ｅ溶液與２．０ｍＬ無水乙醇混合液的吸光度作為對照（Ａ對照）；測定２．０ｍＬＤＰＰＨ•溶液與２．０ｍＬ無水乙醇混合液的吸光度作為空白（Ａ空白）。ＤＰＰＨ•清除率按以下公式計算：ＤＰＰＨ•清除率（％）＝（１－Ａ樣－Ａ對照Ａ空白）×１００。

１．４．３ＡＢＴＳ＋•清除率測定參考Ｒｅ等［１９］的方法，同時作適當修改。取板栗總苞多酚、維生素Ｃ和維生素Ｅ母液，分別稀釋成不同濃度（０．０５０、０．１００、０．１５０、０．２５０、０．３００、０．４００、０．４５０和０．５００ｍｇ／ｍＬ）的溶液。ＡＢＴＳ＋•儲備液配制：配制２．４５ｍｍｏｌ／Ｌ過硫酸鉀，用過硫酸鉀溶解ＡＢＴＳ粉末，配成７ｍｍｏｌ／ＬＡＢＴＳ＋•儲備液，避光、４℃冰箱中保存備用。ＡＢＴＳ＋•測定液配制：將ＡＢＴＳ＋•儲備液以磷酸鹽緩沖液（１０ｍｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ７．４）稀釋，使其吸光度在７３４ｎｍ波長處達到（０．７００±０．０２０）。測定方法：取４ｍＬＡＢＴＳ＋•測定液，加入４０μＬ不同濃度的板栗總苞多酚、維生素Ｃ和維生素Ｅ溶液，振蕩３０ｓ，反應１０ｍｉｎ，在７３４ｎｍ波長處測定吸光度（Ａ樣）。ＡＢＴＳ＋•清除率按以下公式計算：ＡＢＴＳ＋•清除率（％）＝（１－Ａ樣０．７００）×１００。

１．４．４豬油ＰＯＶ測定取板栗總苞多酚母液，分別稀釋成濃度為０（對照組）、５０、１００、１５０和２００μｇ／ｍＬ的板栗總苞多酚溶液，各取４ｍＬ，分別添加到盛有４ｇ豬油的燒杯中，混勻，放于６０℃烘箱里［２０］，每個濃度做３個平行試驗，分別在０、４、８、１２、１６和２０ｄ時，參考ＧＢ／Ｔ５５３８—２００５方法測定豬油中ＰＯＶ。從結果中選取板栗總苞多酚最佳濃度，然后，以同樣的方法和測定時間，測定板栗總苞多酚和維生素Ｃ、維生素Ｅ在此濃度下對豬油中ＰＯＶ的影響。１．５統計分析正交試驗Ｌ１６（４４）由ＳＰＳＳ１６．０軟件生成，采用ＧＬＭ程序對正交試驗結果進行方差分析，并確定提取工藝條件最優化組合。采用ＡＮＯＶＡ程序對板栗總苞多酚與維生素Ｃ、維生素Ｅ抗氧化性進行分析并用Ｔｕｒｋｅｙ進行多重比較。