土壤線蟲(chóng)是植物根際土壤生物區(qū)重要的后生動(dòng)物，在自然界中數(shù)量龐大，種類繁多，且直接參與土壤生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)，對(duì)有機(jī)物的分解、養(yǎng)分轉(zhuǎn)化和能量傳遞起到關(guān)鍵的作用，是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分。土壤線蟲(chóng)生存能力、繁殖能力和環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)，且對(duì)環(huán)境變化敏感，其群落組成能夠反映出土壤的理化和生物性狀，因此土壤線蟲(chóng)成為評(píng)價(jià)土壤健康的重要指示生物。目前，人們對(duì)自然和半自然生態(tài)系統(tǒng)及不同環(huán)境條件和管理措施下農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)的土壤線蟲(chóng)群落進(jìn)行了大量研究[1-3]，揭示了不同土壤條件下土壤線蟲(chóng)的群落特征，并反映出土壤的質(zhì)量狀況。目前，土壤線蟲(chóng)研究多采用線蟲(chóng)形態(tài)鑒定法，這使得土壤線蟲(chóng)群落研究只能在線蟲(chóng)科、屬和功能群水平上進(jìn)行[4]，而且形態(tài)鑒定法工作量大、費(fèi)時(shí)費(fèi)力、難以快速分析多個(gè)土壤樣品的線蟲(chóng)群落特征，這使得土壤線蟲(chóng)研究在物種深度和樣品廣度方面存在缺陷[5]，限制了土壤線蟲(chóng)研究的發(fā)展。隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，分子生態(tài)技術(shù)被應(yīng)用到土壤線蟲(chóng)研究中，為線蟲(chóng)分類鑒定和系統(tǒng)關(guān)系的分析提供了一個(gè)有效的工具。通過(guò)線蟲(chóng)基因序列的比對(duì)分析，不僅可對(duì)線蟲(chóng)進(jìn)行準(zhǔn)確的分子鑒定和系統(tǒng)發(fā)育的研究，而且為線蟲(chóng)姊妹種的鑒定和幼蟲(chóng)的分類提供了可靠的依據(jù)，極大地提高了土壤線蟲(chóng)研究的精度和效率。本文對(duì)分子生態(tài)技術(shù)在土壤線蟲(chóng)研究中的應(yīng)用現(xiàn)狀進(jìn)行綜述，以期為土壤線蟲(chóng)的分子生物學(xué)研究提供參考。

1分子生態(tài)技術(shù)在土壤線蟲(chóng)研究中的優(yōu)勢(shì)

分子生態(tài)學(xué)是生態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)相互滲透、結(jié)合而發(fā)展起來(lái)的新學(xué)科，它依靠分子生物學(xué)的理論和技術(shù)來(lái)分析、解決生態(tài)學(xué)問(wèn)題。分子生態(tài)技術(shù)是分子生態(tài)學(xué)的研究方法，能夠在核酸和蛋白質(zhì)水平上闡明生命系統(tǒng)與環(huán)境系統(tǒng)的相互作用規(guī)律，克服了傳統(tǒng)生態(tài)學(xué)技術(shù)的局限，具有巨大的優(yōu)勢(shì)。在土壤線蟲(chóng)研究中，分子生態(tài)的優(yōu)勢(shì)主要體現(xiàn)在如下4個(gè)方面：

1.1適用于高通量分析

線蟲(chóng)的多個(gè)基因可用于分子鑒定，如18SrDNA、ITS和線粒體DNA等。高通量測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用極大地提高了分子鑒定的效率，這使得宏基因組技術(shù)能夠用于土壤線蟲(chóng)研究，提高了土壤線蟲(chóng)指示土壤環(huán)境質(zhì)量狀況的精度。

1.2能夠進(jìn)行遺傳分析

利用同源基因分析物種的同源性比利用形態(tài)分析更簡(jiǎn)單、可靠。多種線蟲(chóng)的基因序列能夠用于遺傳分析，并構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，確定線蟲(chóng)的進(jìn)化地位。

1.3便于交流分析

線蟲(chóng)分子分類DNA序列登陸到數(shù)據(jù)庫(kù)后，全世界的線蟲(chóng)研究專家可共享、下載數(shù)據(jù)，進(jìn)行分析，這將促進(jìn)土壤線蟲(chóng)研究交流和發(fā)展。

1.4在種水平上鑒定線蟲(chóng)種類

DNA序列是內(nèi)在的遺傳特性，是線蟲(chóng)種類的本質(zhì)特征，因此分子鑒定能夠在本質(zhì)上區(qū)分線蟲(chóng)種類，克服了線蟲(chóng)形態(tài)鑒定的缺陷。線蟲(chóng)形態(tài)鑒定只能在種屬水平上進(jìn)行，且需要在顯微鏡下觀察線蟲(chóng)形態(tài)特征，效率低下。而分子鑒定能在種水平鑒定線蟲(chóng)種類，能夠快速鑒定土壤樣品中的線蟲(chóng)種類，提高了線蟲(chóng)鑒定的精度和豐度。

2分子生態(tài)技術(shù)在土壤線蟲(chóng)研究中的應(yīng)用

2.1分子標(biāo)記技術(shù)

分子標(biāo)記是以個(gè)體間遺傳物質(zhì)內(nèi)核苷酸序列變異為基礎(chǔ)的遺傳標(biāo)記，是DNA水平遺傳多態(tài)性的直接反映，廣泛應(yīng)用于物種分類、遺傳圖譜構(gòu)建和目標(biāo)基因定位等。Vanderknapp等[6]利用隨機(jī)引物PCR區(qū)分了2種親緣關(guān)系較近的食細(xì)菌線蟲(chóng)，表明分子標(biāo)記技術(shù)可應(yīng)用于線蟲(chóng)生態(tài)學(xué)研究。Yeates等[5]認(rèn)為分子技術(shù)需要反映出某些特定線蟲(chóng)種或功能群的相對(duì)數(shù)量，而且至少需要3對(duì)引物對(duì)單條線蟲(chóng)進(jìn)行標(biāo)記。隨后，多種分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用到線蟲(chóng)研究中，如限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）[7]、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性（RAPD）[8]和擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（AFLP）[9]。然而這些方法均具有明顯的缺點(diǎn)，如RFLP的PCR擴(kuò)增片段長(zhǎng)度和酶切片段長(zhǎng)度太短，僅僅提供有限的信息，因此只能對(duì)少量的已知物種進(jìn)行區(qū)分；RAPD和AFLP提供的信息數(shù)量較大，片段長(zhǎng)度為100bp左右，但僅靠片段差異多態(tài)性不能夠區(qū)鑒定出物種種類。

2.2DGGE技術(shù)DGGE技術(shù)

能夠區(qū)分長(zhǎng)度相同、但序列差異的DNA片段。該技術(shù)首先應(yīng)用于微生物群落研究，分析樣品中微生物的物種信息和時(shí)空變化，并可通過(guò)對(duì)條帶的序列分析或與特異性探針雜交分析鑒定群落組成。Waite等[10]將該技術(shù)應(yīng)用到線蟲(chóng)群落研究中，揭示出歐洲草坪土壤線蟲(chóng)種群的多樣性，但未將DGGE分析結(jié)果與線蟲(chóng)形態(tài)鑒定結(jié)果相比較，也未揭示線蟲(chóng)遺傳多樣性和物種豐度信息。Foucher等[11]采用PCR方法擴(kuò)增線蟲(chóng)18SrDNA區(qū)域630bp的片段，并利用DGGE分析擴(kuò)增片段的多樣性，以此鑒定線蟲(chóng)種類，該方法快速高效。雖然DGGE技術(shù)具有較多的優(yōu)點(diǎn)，但僅依靠電泳條帶不能揭示每個(gè)物種的豐度和遺傳進(jìn)化信息，因此不能完全揭示土壤線蟲(chóng)群落特征。

2.3線蟲(chóng)18SrDNA測(cè)序技術(shù)

18SrDNA是編碼真核生物核糖體小亞基rRNA的DNA序列，序列中既有保守區(qū)又有可變區(qū)，保守區(qū)反映了物種間的親緣關(guān)系，可變區(qū)反映出物種間的差異，在系統(tǒng)發(fā)育研究中適用于種級(jí)以上的階元分類。內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS位于核糖體rDNA18S、5.8S和28S之間，屬于中度保守區(qū)域。18SrDNA和ITS序列測(cè)序技術(shù)為分子分類中常用的方法。Floyd等[12]依據(jù)線蟲(chóng)18SrDNA基因序列劃分“分子操作分類單元（MOTU）”，將序列相似度大于99.5%歸為同種線蟲(chóng)。Eyualem等[13]利用18SrDNA測(cè)序方法將形態(tài)鑒定的5種Panagrolaimus線蟲(chóng)重新劃分為2個(gè)種。Griffiths等[14]采用18SrDNA基因克隆文庫(kù)的方法分析了2個(gè)位點(diǎn)的土壤線蟲(chóng)群落結(jié)構(gòu)，通過(guò)BLAST比對(duì)和構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)來(lái)劃分線蟲(chóng)類群，揭示出不同類群線蟲(chóng)的比例，研究發(fā)現(xiàn)土壤線蟲(chóng)以Hoplolaimidae、Telotylenchidae、Cephalobidae和Prat-ylenchus為主，然而分子方法揭示的Rhabditida和Tylenc-hida比例低于形態(tài)學(xué)鑒定的結(jié)果。除了18SrDNA之外，應(yīng)用于線蟲(chóng)分子分類的基因還有ITS[15]和線粒體DNA等[16]。但是，該技術(shù)構(gòu)建克隆文庫(kù)的效率低，難以滿足高通量分析。