多種微塑料降解菌的分離及效能研究

　　摘要：從垃圾填埋場(chǎng)滲濾液中分離篩選塑料降解菌并對(duì) 3 種微塑料的生物降解特性進(jìn)行了研究。以聚乙烯、聚丙烯和聚苯乙烯 3 種微塑料為唯一碳源，篩選潛在降解菌，采用形態(tài)觀察、透射電鏡觀察以及 16S rRNA 基因序列分析對(duì)菌株進(jìn)行鑒定，通過(guò)測(cè)定生物量、重量損失、培養(yǎng)液 pH 以及 FTIR-ATR 和 SEM 分析了 3 種微塑料的生物降解特性。根據(jù) 16S rRNA 基因序列鑒定，分離的 3 株為 Bacillus sp.，Microbacterium sp.，Chryseobacterium sp.。對(duì) 3 種菌株的混合培養(yǎng)物進(jìn)行了 50 d 的生物降解實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，PE、PP、PS 三種微塑料的重量損失分別為 8.7%、 6.3%和 12.5%且 pH 顯著下降;FTIR-ATR 顯示出現(xiàn)了新的官能團(tuán);SEM 觀察發(fā)現(xiàn)微塑料表面出現(xiàn)侵蝕。

　　關(guān)鍵詞：微塑料，垃圾填埋場(chǎng)，菌株分離，生物降解，效能

　　李紅羽; 鄭永杰; 田景芝， 齊齊哈爾大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版) 發(fā)表時(shí)間：2021-11-16

　　近年來(lái)，微塑料污染在世界范圍內(nèi)引起了越來(lái)越多的關(guān)注，已成為一個(gè)新興的研究領(lǐng)域[1]。微塑料被定義為尺寸小于 5 mm 的塑料微粒[2]，由工業(yè)過(guò)程中塑料碎片以及較大塑料的破裂形成[3]。微塑料占塑料廢物的 92.4%[4]，主要包括聚乙烯(PE)、聚丙烯(PP)、聚苯乙烯(PS)、聚氯乙烯(PVC)、聚乳酸、聚酰胺和聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯(PET)等[5]。

　　以往的研究者大量考察了微塑料的分布、攝入、歸宿、行為、量化及其對(duì)生態(tài)的影響[6-10]，但對(duì)于微塑料清除或修復(fù)的方法缺乏深入研究，包括生物降解和塑料聚合物的利用。當(dāng)前對(duì)塑料的處理方式主要是熱解和化學(xué)催化降解[11-12]。相比之下，微生物降解具有污染小、不產(chǎn)生二次污染等特點(diǎn)，是解決塑料降解問(wèn)題的一種綠色環(huán)保且前景良好的方法[13]。目前塑料微生物降解的研究熱點(diǎn)之一是篩選高效降解菌株;同時(shí)，對(duì)菌株降解塑料機(jī)理的深入解析，將會(huì)是塑料污染生物修復(fù)技術(shù)在工程中高效、綠色、低成本應(yīng)用的重要因素。 Yoshida 等[14]研究了 Ideonella sakaiensis 201-F6 對(duì) PET 的降解，該細(xì)菌可以將 PET 作為唯一能源和碳源。Mohan 等[15]的研究表明，Pseudomonas sp.和 Bacillus sp.具有降解溴化 PS 的潛力。Paco 等[16]研究了海洋真菌 Zalerion maritimum 對(duì) PE 顆粒不同培養(yǎng)時(shí)間的反應(yīng)。結(jié)果表明，該真菌能夠利用 PE，并能降低 PE 微粒的質(zhì)量和粒徑。這些研究表明，在自然界中存在著具有微塑料降解潛力的菌種資源。

　　垃圾填埋場(chǎng)微生物多樣性十分豐富[17]，是天然的塑料降解菌株富集場(chǎng)所。因此，本研究擬開(kāi)展以下研究?jī)?nèi)容：(1)從垃圾填埋場(chǎng)滲濾液中分離和鑒定降解微塑料的細(xì)菌菌株;(2)研究混合菌對(duì)微塑料生物降解的影響;(3)通過(guò)測(cè)定生物量、重量損失、培養(yǎng)液 pH，并利用 FTIR-ATR 以及 SEM 分析聚合物中結(jié)構(gòu)變化來(lái)評(píng)估細(xì)菌對(duì)微塑料的生物降解特性。

　　1 實(shí)驗(yàn)部分

　　1.1 試劑與儀器

　　磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、七水合硫酸鎂、硝酸銨、氯化鈉、七水合氯化亞鐵、七水合硫酸鋅、硫酸鎂、胰蛋白胨、酵母提取物、瓊脂粉，所有試劑購(gòu)買(mǎi)自上海阿拉丁生化科技有限公司，均為分析純?cè)噭?DL-CJ-1ND2 型超凈工作臺(tái)，北京哈爾儀器制造有限公司;TS-112B 型震蕩恒溫培養(yǎng)箱，上海善志儀器設(shè)備有限公司;臺(tái)式高速離心機(jī)，上海盧湘儀有限公司;LX-B50 L 型高壓蒸汽滅菌器，合肥華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司;S-3400 掃描電子顯微鏡(SEM)，株式會(huì)社日立制作所;H-7650 型透射電鏡(TEM)，株式會(huì)社日立制作所;Specdrum 傅里葉變換紅外光譜，美國(guó) PE 公司。

　　1.2 菌株的富集及分離

　　以 PE、PP 和 PS 為供試微塑料，將收集到的垃圾滲濾液樣品，用生理鹽水稀釋 1 000 倍，再將 1mL 的稀釋液加到 100mL 的以微塑料聚合物(2 g/L)作為唯一碳源的無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中，120 r/min、27 ℃培養(yǎng)，并測(cè)定菌液在 600 nm 處的吸光度(表示為 OD600)，同時(shí)觀察菌株對(duì)塑料的降解情況。待液體培養(yǎng)基中菌液濃度上升并趨于穩(wěn)定后，取 1mL 菌液到 100mL 新鮮培養(yǎng)基中進(jìn)行傳代培養(yǎng)，每 7d 進(jìn)行一次傳代，每次傳代設(shè)置 3 個(gè)重復(fù)。最后利用平板對(duì)富集液進(jìn)行分離純化，得到潛在降解菌株的純培養(yǎng)物。

　　1.3 菌株的觀察及鑒定

　　細(xì)菌樣品固定在 2.5%戊二醛溶液 4 h，去除樣品中的雜質(zhì)，并用 100 mmol/L 磷酸緩沖溶液(pH=7.0)沖洗樣品 3 次，每次 15min，用一系列濃度(25%, 50%, 75%, 95%)乙醇溶液脫水，每個(gè)濃度處理 20min，最終浸泡在無(wú)水乙醇中，采用 TEM 分析細(xì)菌形態(tài)。將篩選出的 3 株菌送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行 16S rRNA 基因測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與 NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性比對(duì)分析，并下載同源性高的菌種序列信息，進(jìn)一步用 MEGA-X 軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。

　　1.4 生物降解實(shí)驗(yàn)

　　將上述步驟中分離出的 3 種塑料降解菌的純培養(yǎng)分別接種于滅過(guò)菌的 LB 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待菌株生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期后，將培養(yǎng)液于離心機(jī)中 8 000 r/min 離心 10 min，離心后倒去上清液，加入滅菌的生理鹽水再于離心機(jī)中 8 000 r/min 離心 10 min，棄去上清液，重復(fù)兩次，最后一次加入生理鹽水分散菌體，稀釋菌液至 OD600等于 1.0 左右，以上操作均在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行。分別取活化后的 3 種菌株以及混合后的菌株各 1 mL，分別接種于含有 2 g 微塑料(PE、PP 和 PS)的 100 mL 的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基培養(yǎng)液中。以含有微塑料但未接種降解菌的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基做為對(duì)照，27 ℃，120 r/min 振蕩培養(yǎng) 50 d，每組做 3 個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，50 d 后測(cè)定菌株的生物量 OD600、重量損失以及培養(yǎng)液 pH，考察生物降解特性。

　　1.5 菌株降解特性的研究

　　為了便于精確測(cè)定殘留微塑料的失重，通過(guò)過(guò)濾和篩分從培養(yǎng)基中回收微塑料。用 75%的乙醇清洗微塑料，60 ℃烘干一夜，去除附著在塑料顆粒上的生物膜。通過(guò)使用可讀性為 0.000 1g 的分析天平來(lái)測(cè)定殘留聚合物的重量，以測(cè)定生物降解程度。微塑料的失重率按百分比計(jì)算為

　　(初始重量-重量)/初始重量×100%。生物降解過(guò)程中聚合物官能團(tuán)的形成或消失可以通過(guò) FTIR 進(jìn)行監(jiān)測(cè)。本研究使用配備衰減全反射率(ATR)金剛石晶體附件的 FTIR 光譜分析，回收的微塑料用無(wú)菌水沖洗 3 次，再用 75%的乙醇清洗微塑料，以 4 cm-1的分辨率和 4000~500cm -1的頻率范圍對(duì)微塑料顆粒的表面官能團(tuán)進(jìn)行表征。

　　經(jīng)混合菌處理 50 d 后的 3 種微塑料樣品用蒸餾水洗滌 3 次，再用 75%乙醇沖洗，去除表面的細(xì)菌，使最大表面暴露出來(lái)，以便觀察。在 25mA、0.3MPa 氬氣氣氛下濺射金微塑料涂層，采用 SEM 進(jìn)行監(jiān)測(cè)。

　　2 結(jié)果與討論

　　2.1 菌株的分離與鑒定

　　分離得到的 3 株菌命名為 LY1，LY2，LY3 三者均能以不同微塑料聚合物作為唯一碳源生長(zhǎng)。這一結(jié)果表明這 3 種菌株物具有降解 PE、PP 和 PS 塑料的能力。他們利用聚合物的能力可能源于他們對(duì)塑料滋生環(huán)境的適應(yīng)性。

　　2.1.1 菌株的形態(tài)學(xué)觀察

　　在 LB 固體培養(yǎng)基中，LY1 的單菌落邊緣呈不規(guī)整白色干枯狀圓形菌落，直徑 2~3 mm;LY2 的單菌落呈黃色，表面光滑、凸起、濕潤(rùn)，直徑 1 mm 左右，LY3 的單菌落呈橘黃色，表面光滑、凸起、濕潤(rùn)，直徑 2~3 mm，如圖 1(a),(b),(c)所示。在透射電鏡下，LY1 的形態(tài)呈長(zhǎng)桿狀，LY2 的形態(tài)呈短棒狀，LY3 的形態(tài)呈短桿狀，如圖 1(d),(e),(f)所示。

　　2.1.2 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建

　　將 3 種菌株(LY1、LY2、LY3)的 16S rRNA 基因序列進(jìn)行 BLAST 同源性比較分析，選擇相似度在 99.05% 以上的 10 組同源序列制作系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)(如圖 2)，經(jīng)比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)菌株 LY1、LY2、LY3 分別與 Bacillus sp.，Microbacterium sp.，Chryseobacterium sp.在同一分支上，親緣關(guān)系最近。根據(jù)上述形態(tài)學(xué)觀察以及進(jìn)化樹(shù)的對(duì)比結(jié)果，菌株 LY1、LY2、LY3 被鑒定為 Bacillus sp.，Microbacterium sp.，Chryseobacterium sp.。

　　2.2 分離菌的生物降解試驗(yàn)

　　在生物降解實(shí)驗(yàn)中，菌株的生長(zhǎng)曲線顯示，3 種菌對(duì)不同的微塑料表現(xiàn)出不同的代謝反應(yīng)(如圖 3)，且混菌均在培養(yǎng)基中濃度更高，生長(zhǎng)更快，因此，接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)將對(duì) 3 種菌株的混合培養(yǎng)物進(jìn)行的生物降解特性的研究。

　　圖 4 為混合菌株在 3 種微塑料為碳源的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中的生物降解實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò) 50 d pH 的變化。微塑料的降解顯著降低了培養(yǎng)液的 pH，培養(yǎng)液的 pH 從均初始中性 7.2 變化到 6.0 左右。Gong 等 [18]認(rèn)為，微生物與微塑料一起培養(yǎng)導(dǎo)致微塑料逐漸緩慢降解，改變了微塑料聚合物基體的微觀結(jié)構(gòu)，并分泌了酸性副產(chǎn)物，這導(dǎo)致了培養(yǎng)液中 pH 降低。pH 的降低證明培養(yǎng)物仍然具有代謝活性微生物分泌多種胞內(nèi)和胞外酶到培養(yǎng)基中，這些酶可能對(duì)聚合物的降解起作用。在聚合物降解過(guò)程中，復(fù)雜聚合物首先被外酶分解成短鏈或單體，外酶小到足以滲透細(xì)胞壁，通過(guò)解聚過(guò)程用作碳和能源[19]。

　　2.3 生物降解特性

　　2.3.1 微塑料聚合物的失重分析

　　失重率的測(cè)定是測(cè)定生物降解最有效的方法[20]。50 d 的降解期結(jié)束后，微塑料的質(zhì)量減輕可歸因于降解菌的生物降解。將 3 種微塑料 50 d 后的失重率進(jìn)行了比較，50 d 后菌株對(duì) PE、PP 和 PS 的最大失重率為混合菌作用體系下的失重，失重率分別為 6.7%、4.3%和 8.2%，對(duì)照組(未接種降解菌)中基本無(wú)質(zhì)量的變化。混合菌對(duì)微塑料質(zhì)量的改變是由于混合菌共同發(fā)揮作用致使微塑料化學(xué)鍵斷裂，導(dǎo)致微塑料聚合物羰基和末端雙鍵指數(shù)增加[21]，使得菌體分泌的胞外酶能夠更快的啟動(dòng)適應(yīng)機(jī)制進(jìn)行生物氧化或水解，且 PS 的失重率>PE 的失重率>PP 的失重率，這種質(zhì)量損失可能是由于降解菌的基因組成，菌株可能具有相當(dāng)大的聚合物降解能力，對(duì)于不同塑料降解方面存在的差異可能是代謝率和聚合物吸收機(jī)制存在差異。

　　2.3.2 微塑料聚合物的紅外光譜分析(FTIR-ATR)

　　為了估計(jì)生物降解后微塑料的結(jié)構(gòu)變化，分析了微塑料紅外輻射吸收率;當(dāng)微生物引入氧化基團(tuán)時(shí)，非極性鍵轉(zhuǎn)化為極性鍵，導(dǎo)致不穩(wěn)定性增加，并為微生物定居和酶斷裂提供場(chǎng)所[21]。3 種類(lèi)型的微塑料顆粒經(jīng)混合菌在無(wú)碳源培養(yǎng)基中培養(yǎng) 50 d 后，在 4 000~500 cm -1的頻率范圍內(nèi)，通過(guò) ATR 分析生物降解的 3 種微塑料顆粒的化學(xué)結(jié)構(gòu)，如圖 5 所示。圖 5(a)為 PE 經(jīng)不同菌株作用后的紅外輻射吸收率，在 2915.3, 2846.4 , 1 466.4, 720.6cm -1處出現(xiàn)特征峰[22]。2 915.3, 2 846.4 cm -1處的強(qiáng)帶分別對(duì)應(yīng)于烷烴分子中脂肪族 C—H 鍵的不對(duì)稱和對(duì)稱振動(dòng)，1 466.4 cm -1和 720.6 cm -1處的強(qiáng)峰分別是由于 C=C 鍵拉伸、亞甲基(—CH2)基團(tuán)、芳香族(C—H)彎曲和具有 4 個(gè)碳原子的長(zhǎng)直鏈烷烴鍵。PE 僅由碳和氫原子組成。經(jīng)混合微生物作用后， PE 在 1 620.2 cm -1和 1 253.1 cm -1處均出現(xiàn)了新的吸收帶，可能是由于形成氨基和羥基化合物，羰基帶被胺基帶取代表明菌株在微塑料誘導(dǎo)的環(huán)境中有良好的代謝，也可能是 PE 的化學(xué)結(jié)構(gòu)受到逐漸干擾而導(dǎo)致降解的證據(jù)[23]，這些發(fā)現(xiàn)可能是由于菌株的作用導(dǎo)致 PE 氧化。圖 5(b)為 PP 微塑料經(jīng)不同菌株作用后官能團(tuán)變化，生物降解后的 PP 微塑料在 3 416.6 cm -1處形成了一個(gè)寬而強(qiáng)的峰，該峰賦值于 O—H，在未接種菌株的 PP 微塑料中，1462.8 cm -1處的羰基帶(C=O)較強(qiáng)且拉長(zhǎng)[24]，而在接種了菌株的 PP 微塑料中，羰基帶移到了 1 575.2 cm -1處;2 963.2~2 830.4 cm -1處的 C—H 脂肪族拉伸峰和 1 462.8 cm -1處的 C—H 脂肪族彎曲峰也有明顯的減少;峰在 1 455 cm -1處的還原被認(rèn)為是 C=C 的芳香族延伸;在 998cm -1和 973 cm -1處的吸收峰的伸長(zhǎng)率屬于 C=C 彎曲[25]。圖 5(c)為 PS 微塑料經(jīng)不同菌株作用后官能團(tuán)變化，觀察到的鍵振動(dòng)有 2866.7~ 3 028.5 cm -1處的 C—H 鍵，1 491.1~1450.5cm -1處的 C=C 鍵[26]。在接種了混合菌株的 PS 中，可以觀察到 1 248.8 cm -1處的 C—O 和 1 349.6 cm -1處的 C—H 鍵的酚醛譜帶以及峰的縮小。不同頻率下形成的氧化產(chǎn)物表明聚合物被微生物降解。

　　2.3.3 微塑料聚合物的 SEM 觀察

　　如圖 6 所示，在掃描電子顯微鏡下，微塑料發(fā)生了形態(tài)學(xué)變化。與混合菌培養(yǎng) 50d 后，微塑料表面變得粗糙，并有侵蝕、裂紋和溝槽，如圖 6(d)~(f)，未接種降解菌的對(duì)照組圖 6(a)~(c)表面光滑。3 種微塑料的表面變化表明，混合菌能夠粘附在微塑料料聚合物表面形成菌落并造成表面損傷。在 El-Sayed 等[27]關(guān)于聚乙烯降解的研究中，SEM 分析證實(shí)了微生物在聚合物表面聚集，去除微生物后聚合物表面也發(fā)生物理坑蝕，這一結(jié)果為微塑料在微生物作用下的劣化提供了證據(jù)，并證實(shí)了微生物的降解能力[28]。利用 SEM 作為分析 工具，展示塑料表面上形成的侵蝕、空洞和孔洞，以指示定值和降解的程度。利用 SEM 評(píng)價(jià)塑料聚合物的宏觀改性，如表面劣化、孔洞的形成、裂紋等變化，是一種可靠的聚合物生物降解評(píng)價(jià)方法。

　　3 結(jié)論

　　(1)將城市垃圾填埋場(chǎng)的垃圾滲濾液作為降解菌來(lái)源，在以微塑料作為唯一碳源的液體培養(yǎng)基中馴化菌株，通過(guò)劃線分離等步驟得到 3 株菌經(jīng) 16S rRNA 基因鑒定為 Bacillus sp.、Microbacterium sp.、 Chryseobacterium sp.，由于菌體生長(zhǎng)濃度的增加以及微塑料的質(zhì)量損失，說(shuō)明從垃圾滲濾液中成功分離出對(duì)微塑料具有潛力的細(xì)菌。

　　(2)通過(guò)測(cè)定生物量、重量損失、培養(yǎng)液 pH、ATR-FTIR 以及 SEM 觀察，探究 3 種菌分別對(duì)不同微塑料的降解特性，并驗(yàn)證 3 種混菌混合培養(yǎng)能否提高生物降解效率。實(shí)驗(yàn)觀察到在單獨(dú)菌以及混合菌 50 d 的作用下，微塑料質(zhì)量均有不同程度的損失并生成了新的含氧基團(tuán)，但混合菌作用下的微塑料失重率最高，說(shuō)明菌株的混合培養(yǎng)提高了微塑料的生物降解效率。

　　(3)盡管這是一項(xiàng)緩慢的技術(shù)，但這表明了從周?chē)h(huán)境中發(fā)現(xiàn)可降解傳統(tǒng)類(lèi)型塑料的微生物的可能性很大。今后的研究應(yīng)致力于闡明塑料降解的途徑并深入了解微生物酶在生物降解中的作用，將有利于開(kāi)發(fā)新的塑料聚合物生物修復(fù)策略。