貴州六盤水地區大白菜黑斑病病原菌鑒定及培養特性研究

　　摘  要：黑斑病是大白菜重要病害之一，常對大白菜田間生產造成嚴重損失。為明確引起貴州省六盤水地區大白菜黑斑病的病原菌種類，采用稀釋涂布法從六盤水地區 4 個種植點大白菜黑斑病病樣上分離到 4 個菌株?；谛螒B學和 ITS、Alt-a1、 tef-1 多基因序列分析，4 個菌株的鑒定結果均為蕓薹鏈格孢 Alternaria brassicae。生物學特性研究表明，該病原菌最適培養基為 PDA，最適氮源為酵母浸粉和蛋白胨，最適碳源為葡萄糖;菌絲生長及孢子萌發最適溫度均為 25 ℃，菌絲生長最佳 pH 值為 7;分生孢子致死溫度為 55 ℃下處理 10 min。

　　關鍵詞：大白菜;黑斑病;蕓薹鏈格孢;系統鑒定;生物學特性

　　龍巧芳; 梁文; 蔣芹娜; 吳鳳康; 李倩; 楊友聯; 張曉勇 中國蔬菜 2022-01-13

　　黑斑病又稱黑霉病，是大白菜常見的重要病害之一，發病面積廣，近年暴發呈上升趨勢。黑斑病早期在大白菜上形成 2～5 mm 的灰褐色近圓形斑，并有圓環狀同心輪紋，外圍呈淡黃色暈圈，病斑中央常見黑色霉狀物;后期病斑逐漸擴大，病部干枯穿孔，嚴重時整株葉片枯死(董偉，2012)。黑斑病在早春發生最為嚴重，最適發病溫度為 13～15 ℃，低溫、高濕和雨霧天氣最適病害暴發和流行(鄧奇，2011)。前人研究表明，鏈格孢屬(Alternaria)多種真菌如蕓薹鏈格孢 A. brassicae、蘿卜鏈格孢 A. japonica(馬海霞 等，2013;云曉敏等，2015)、蕓薹生鏈格孢 A. brassicicola、蕪菁鏈格孢 A. napiformis(張天宇，2003)、日本鏈格孢 A. japonica(Ren et al.，2012)、鏈格孢 A. alternate、細極鏈格孢 A. tenuissima(Dunbar et al.，2017;郭 潤 婷，2018)、 茄 鏈 格 孢 A.solani(Shi et al.， 2021)等都可為害大白菜葉片并形成黑斑病癥狀，有時多種鏈格孢真菌復合致病，給病害的識別和防治造成一定困難。

　　前人對大白菜黑斑病病原菌已有一定研究，但該病的病原菌種類繁雜，存在明顯的季節性和區域性，同時對病原菌的生物學特性研究也缺乏系統性，不利于該病的識別、傳播規律調查及田間防治。本試驗對貴州省六盤水地區 4 個種植點的大白菜黑斑病病樣進行病原菌分離，結合形態學和多基因分子生物學方法對病原菌進行鑒定，并研究了該病原菌的生物學特性和致死溫度等，以期為六盤水地區大白菜黑斑病田間準確識別及防治提供理論及實踐參考。

　　1  材料與方法 1.1  病原菌分離純化

　　2019、2020 年春季分別在貴州省六盤水市鐘山區明湖村、水城區野鐘鄉、六枝特區新場鄉和盤州市大山鎮 4 個大白菜種植點進行田間病害調查和采樣，每個種植點隨機采集 1 份病葉并單獨裝入保鮮袋中帶回實驗室，采用稀釋涂布法分離、純化得到 BA20191205、BA20191215、BA190721、 BA190629 等 4 個菌株。菌株在 PDA 試管斜面上培養 10 d 后置于 4 ℃冰箱保藏備用。

　　1.2  病原菌形態學鑒定

　　分別將 4 個菌株接種于 PDA 培養基平板上進行活化培養。打取直徑 6 mm 的菌落邊緣小菌餅，接入另一 PDA 平板中央，25 ℃、自然光照條件下培養 10 d 后采用十字交叉法測量菌落直徑，觀察菌落特征。

　　同時將 4 個菌株分別接種于馬鈴薯胡蘿卜瓊脂(PCA)培養基(20 g 去皮馬鈴薯和 20 g 胡蘿卜切成小塊，加蒸餾水小火熬煮 30 min 后雙層紗布過濾得到濾液，加入 18 g 瓊脂，定容至 1 000 mL 后滅菌備用)平板，20 ℃、自然光照條件下誘導產孢，然后刮取菌落表面分生孢子制成臨時裝片，采用奧林巴斯 BX51 顯微攝像系統對分生孢子形態特征進行觀察和拍攝，并采用 Spot32 v4.0.8 軟件測量其顯微尺寸。

　　1.3  病原菌分子鑒定

　　分別將 4 個菌株接種于 PDA 平板上，25 ℃ 恒溫培養 10 d 后刮取菌絲，采用改良的 CTAB 法提取菌株 DNA(張穎慧 等，2008)。擴增的目的序列分別為內部轉錄間隔區(ITS)、鏈格孢抗原相關蛋白基因(Alt-a1)和翻譯延長因子 1α 亞基基因(tef-1)3 個基因片段。ITS 序列引物為 ITS4(TCCTCCGCTTATTGATATGC) 和 ITS5 (GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG)，Alt-a1 序列引物為 Alt-for(ATGCAGTTCACCACCATCGC)和 Alt-rev(ACGAGGGTGAYGTAGGCGTC)， tef-1 序列引物為 EF1-526F(GTCGTYGTYATYGG HCAYGT)和 EF1-1567R(ACHGTRCCRATACCAC CRATCTT)(Lawrence et al.，2013;Nishikawa & Nakashima，2020)。

　　PCR 反應體系及擴增程序參考 Woudenberg 等(2013)的方法。擴增產物經 1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測后，由北京擎科生物技術有限公司進行純化和測序，所得序列已提交至 GenBank。將所得序列輸入 GenBank 的 BLAST 中進行同源序列檢索，查找相似性較高的菌株(表 1)。

　　3 個基因序列利用 Sequence Matrix 1.7.8 進行拼接，運用 MEGA X 軟件的極大似然法(maximum likelihood method，ML)構建系統發育樹，確定菌株的分類地位。

　　1.4  菌株致病性鑒定

　　供試大白菜品種為中華青(市售)，5 葉期選取健壯無病害的幼苗定植于裝有滅菌草炭基質的花盆，置于 20 ℃光照培養箱中，緩苗后使用 75% 的酒精棉球對葉片進行消毒，無菌水清洗 4～5 次，無菌吸水紙吸去表面水分后用灼燒冷卻的接種針對由內向外數第 5 片葉形成微創傷口，用 2 mm 打孔器打取菌株 BA20191205 菌落邊緣小菌塊接種于微創傷口處(以菌絲面接觸傷口)，再將幼苗置于 20 ℃、光照 10 h/黑暗 14 h 的光照培養箱中進行培養，7 d 后觀察其致病效果。以接種直徑 2 mm 的無菌瓊脂塊為對照，每處理接種 3 株，6 次重復。

　　如葉片發病，待病斑部位產生分生孢子后，刮取分生孢子用稀釋涂布法進行分離純化，并對分離的菌株與原菌株進行比較。

　　1.5  病原菌菌絲生長及孢子萌發最佳溫度及 pH 測定

　　用 6 mm 打孔器打取菌株 BA20191205 菌落邊緣菌餅，單點接種于 PDA 平板中央，分別置于 0、 5、10、15、20、25、30、35 ℃ 等 8 個溫度條件下，每處理接種 3 皿，3 次重復。10 d 后測量各處理的菌落直徑。

　　利用 1 mol · L-1 NaOH 或 HCl 調節 PDA 培養基 pH 值至 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13 等 10 個梯度，制成平板;然后用 6 mm 打孔器打取菌株 BA20191205 菌落邊緣菌餅，單點接種于 PDA 平板中央，每處理接種 3 皿，3 次重復。25 ℃條件下培養 7 d，測量各處理的菌落直徑。

　　用滅菌解剖刀刮取菌株 BA20191205 菌落表面的分生孢子懸浮于無菌水中，利用血球計數板統計孢子懸浮液中的孢子密度，并用無菌水稀釋孢子懸浮液濃度至 1 × 106 個 · mL-1 。用移液槍吸取 100 μL 孢子懸浮液加入 PDA 平板，均勻涂布后分別置于 0、5、10、15、20、25、30、35 ℃等 8 個溫度條件下，每處理接種 3 皿，3 次重復。24 h 后將涂布平板置于奧林巴斯 BX51 顯微攝像系統下，隨機選取 10 個視野統計分生孢子萌發情況。

　　1.6  菌株生長最佳培養基、碳源及氮源篩選

　　設 置 5 種 培 養 基 處 理：PDA 培 養 基、10% PDA 培養基、PCA 培養基、10% PCA 培養基、合成低營養瓊脂(SNA)培養基(0.2 g KH2PO4，0.2 g KCl，1.0 g KNO3，0.5 g MgSO4 · 7H2O，0.2 g 葡萄糖，15 g 瓊脂，1 000 mL 蒸餾水，自然 pH 值)(周曉榕 等，2006;張曉勇 等，2019)。用 6 mm 打孔器打取菌株 BA20191205 菌落邊緣菌餅，單點接種于不同配方培養基平板中央，每處理接種 3 皿，3 次重復。25 ℃條件下培養 7 d，測量各處理的菌落直徑。

　　以查氏培養基(1 g K2HPO4，3 g NaNO3，0.01 g FeSO4，0.50 g KCl，0.50 g MgSO4 · 7H2O，30 g 蔗糖，15 g 瓊脂，1 000 mL 蒸餾水，自然 pH 值)為基礎培養基(周曉榕 等，2006)，分別用相同質量的可溶性淀粉、甘油、麥芽糖、葡萄糖替代蔗糖，得到 5 種含不同碳源的培養基;分別用相同質量的硝酸銨、氯化銨、蛋白胨、酵母浸粉、硝酸鉀替代硝酸鈉，得到 6 種含不同氮源的培養基。用 6 mm 打孔器打取菌株 BA20191205 菌落邊緣菌餅，單點接種于不同碳源或氮源的培養基平板中央，每處理接種 3 皿，3 次重復。25 ℃條件下培養 7 d，測量各處理的菌落直徑。

　　1.7  菌株致死溫度測定

　　取 1 000 μL 濃度為 1 × 106 個 · mL-1 的菌株 BA20191205 孢子懸浮液，加入 1.5 mL 無菌離心管 中， 分 別 放 入 35、40、45、50、55、60、65、 70 ℃水浴中，每處理 3 管，3 次重復;精確計時 10 min，各處理分別取 100 μL 孢子懸浮液均勻涂布于水瓊脂(WA)培養基平板上(劉一賢 等， 2015)，25 ℃條件下培養 24 h，然后在奧林巴斯 BX51 顯微攝像系統下隨機選取 10 個視野，統計分生孢子萌發情況。

　　1.8  數據處理

　　運用 DPS v7.05 軟件對試驗數據進行方差分析和多重比較。

　　2  結果與分析 2.1  病原菌形態學及致病性鑒定

　　大白菜黑斑病主要發生在葉片上，初期形成輪紋狀黑斑，嚴重時造成穿孔(圖 1-A)。經分離純化，在 PDA 平板上 25 ℃培養 10 d 后菌落直徑為(44.6 ± 2.7)mm，邊緣整齊，菌絲呈褐色，并且分泌黑褐色素，菌落表面淡黃色，背面褐色且有明顯輪紋(圖 1-B、C)。在 PCA 平板上形成的分生孢子多為單生，少數形成 2～3 個孢子的短鏈(圖 1-D);孢身直立或略彎曲，淡灰褐色至褐色，倒棒 狀，(74.2～148.8)μm ×(16.7～35.5)μm， 具橫隔膜 4～15 個，縱、斜隔膜 0～6 個(圖 1-E～H);喙柱狀，長 28.80～84.95 μm，淡灰褐色，多有分隔。基于形態特征分析，初步將 4 個菌株鑒定為蕓薹鏈格孢 Alternaria brassicae(Berk.)Sacc.(Wiltshire， 1945)。

　　將菌株 BA20191205 接種于健康大白菜葉片上，20 ℃培養 7 d 后與對照相比，接種處形成 5～ 10 mm 的灰褐色病斑，并有顯著的圓環狀同心輪紋，與田間大白菜黑斑病早期癥狀相似(圖 1-I)。再次挑取黑色霉層進行分離純化，所得菌株菌落及分生孢子形態特征與原菌株一致。

　　2.2  病原菌分子生物學鑒定

　　將本試驗中分離得到的 4 個菌株的 ITS、 Alt-a1 和 tef-1 序列與從 GenBank 中下載的 22 個同源性較高的序列(表 1)，以 Alternaria nobilis CBS116490 作為外類群(Nishikawa & Nakashima，2020)，利用 MEGA X 軟件構建 ML 系統發育樹(圖 2)。結果表明，4 個菌株都與蕓薹鏈格孢 A.brassicae 以 100% 的 高 支 持 率 聚 為 一 支， 即這 4 個菌株均為蕓薹鏈格孢 Alternaria brassicae (Berk.)Sacc.。

　　2.3  不同碳源、氮源和不同培養基對病原菌菌絲生長的影響

　　不同碳源、氮源和培養基配方對病原菌菌絲生長的影響達到顯著水平(圖 3)。該病原菌在 PDA 培養基中的菌絲生長速度顯著高于其他培養基，說明該病原菌最適生長培養基為 PDA(圖 3-A)。相同條件下，菌株在以葡萄糖為碳源的培養基中的菌落直徑顯著大于其他處理，說明葡萄糖為該病原菌最佳生長碳源(圖 3-B);菌株在以酵母浸粉和蛋白胨為氮源的培養基中生長最佳(圖 3-C)，菌落直徑顯著大于其他處理。

　　2.4  不同培養溫度和 pH 對病原菌菌絲生長及孢子萌發的影響

　　不同培養溫度對病原菌菌絲生長速度及孢子萌發率的影響均達到顯著水平(表 2)。在 5～30 ℃ 范圍內，該病原菌菌絲均可生長，孢子均能萌發， 25 ℃處理的菌絲生長速度最快，孢子萌發率最高， 在 20～30 ℃范圍內孢子萌發率差異不顯著;當溫度低于 0 ℃或超過 35 ℃后菌絲即停止生長，孢子萌發率也急劇下降。不同 pH 培養基處理對病原菌菌絲生長的影響也達到了顯著水平(圖 4)，pH 值在 6～8 范圍內該病原菌生長良好，最佳 pH 值為 7。

　　2.5  病原菌致死溫度測定

　　病原菌孢子萌發率顯著降低;當處理溫度達到 55 ℃后，孢子萌發率降為 0。說明病原菌致死溫度為 55 ℃處

　　3  結論與討論

　　近年來，大白菜黑斑病在貴州六盤水地區為害區域呈擴大趨勢，前期田間調查發現，所選擇的大白菜種植點在 3—4 月均有黑斑病發生，嚴重的地塊發病率達到 80%～100%，給大白菜的產量和品質造成嚴重損失。本試驗采用形態學結合 ITS、 Alt-a1、tef-1 多基因序列分析，確定六盤水地區 4 個菌株均為蕓薹鏈格孢 Alternaria brassicae。蕓薹鏈格孢是世界性分布的弱寄生病原菌，其寄主專化性不強，除了常導致大白菜、蘿卜、甘藍、芥菜等蕓薹屬植物的葉部病害，以及蘆薈(Ghosh & Banerjee，2014)、 辣 根(Blagojevi et al.，2015)、龍 葵(Caesar & Lartey，2009) 和 柚 木(Borges et al.，2018)等多種非蕓薹屬植物葉斑病，還可引起葉用萵苣(生菜)等植物的根腐病(石延霞 等， 2019)，對多種農作物的生產造成影響。大白菜黑斑病病原菌較為復雜，其分布存在明顯的區域性。郭潤婷(2018)調查發現，大白菜黑斑病病原菌在內蒙古主要為細極鏈格孢 A. tenuissima，在山東主要為蕓薹生鏈格孢 A. brassicicola，在北京主要為鏈格孢 A. alternate。同時，大白菜黑斑病病原菌分布還存在明顯的季節性和周期性，秋冬季一般由蕓薹鏈格孢引起，而春夏季主要由蕓薹生鏈格孢引起(李明遠，2004;王風敏 等，2007)。本試驗中，蕓薹鏈格孢在 20～25 ℃下菌絲生長速度和孢子萌發率都較高，前人報道蕓薹鏈格孢在 14.6 ℃時附著胞形成率最高(馬海霞 等，2013)，而蕓薹生鏈格孢最適生長溫度為 25～30 ℃(王春明 等，2020)，說明蕓薹鏈格孢是低溫型病原菌，蕓薹生鏈格孢是高溫型病原菌，大白菜黑斑病病原菌的區域性和季節性變化是由其生物學特性決定的。本試驗中早春在六盤水地區采集的大白菜黑斑病材料的病原菌均為蕓薹鏈格孢，未發現蕓薹生鏈格孢，與上述研究結果一致。

　　早期鏈格孢屬真菌分類主要是基于分生孢子結構，Simmons(1992)依據分生孢子成鏈特性、孢身結構、喙的有無和喙形態等制定了詳細的鏈格孢形態學分類標準。但鏈格孢種內和種間孢子形態變化幅度大，種間形態特征常常會交叉，形態鑒定無法保證準確性(張天宇，2003)，且分生孢子形態會受到培養條件的影響，因此現在普遍采用 PCA 培養基來進行鏈格孢產孢誘導，以方便比較種間菌落形態、分生孢子成鏈特性及顯微結構，以提高鏈格孢形態鑒定的準確度(Simmons，2007)。分子生物學方法是鏈格孢鑒定有力的補充，現廣泛用于鏈格孢屬真菌鑒定的基因主要有 ITS、GAPDH、RPB2、tef-1、endoPG、Alt-a1 等(Nishikawa & Nakashima，2020)。蕓薹鏈格孢對環境適應性極強。該病原菌主要在植物殘體和土壤中越冬，成為翌年的初侵染源(鄧奇，2011)。本試驗結果表明，蕓薹鏈格孢在 pH 值 4～11 范圍內均能生長，但對堿性條件相對較為敏感;分生孢子在 55 ℃下處理 10 min 即完全失去萌發能力，比李明遠和柯常取(1991)測得的菌絲致死溫度高 5 ℃，可能是由于分生孢子耐熱性高所致。因此，生產上可采用撒施石灰配合夏季高溫悶棚或土壤火焰消毒等措施降低土壤初侵染菌量來預防病害的發生。蕓薹鏈格孢分生孢子不耐干旱，需要相對濕度在 75% 時才能在葉片上萌發(李明遠和柯常取，1991)，因此生產中在持續低溫、高濕條件下要重點監測和預防黑斑病。本試驗中，以含蛋白質較高的酵母浸粉、蛋白胨作為氮源可顯著促進蕓薹鏈格孢生長，所以生產中要合理施肥，避免偏施氮肥，以減輕黑斑病的發生。