轉(zhuǎn)人溶菌酶牛乳營養(yǎng)成分及食用安全研究

　　摘要 [目的]探究轉(zhuǎn)人溶菌酶牛乳和非轉(zhuǎn)基因牛乳的營養(yǎng)成分差異，以及重組人溶菌酶的食用安全性。[方法]通過測定轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因組 2 種乳樣乳常規(guī)、氨基酸和脂肪酸的含量，比較其成分差異。通過大鼠、小鼠急性經(jīng)口毒性試驗以及模擬胃腸液消化穩(wěn)定性試驗檢測重組人溶菌酶的食用安全性。[結(jié)果]營養(yǎng)成分檢測結(jié)果表明，轉(zhuǎn)人溶菌酶牛乳和非轉(zhuǎn)基因牛乳相比，細(xì)菌總數(shù)偏高，脂肪含量偏低，其他營養(yǎng)成分無明顯的變化; 食品安全評估說明重組人溶菌酶屬于實際無毒蛋白，且無潛在的致敏性。[結(jié)論]該試驗驗證了轉(zhuǎn)人溶菌酶牛乳的食用安全性。

　　本文源自程靜然; 宋榮榮; 戴蘊平; 趙春江， 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué) 發(fā)表時間：2021-06-08

　　關(guān)鍵詞 轉(zhuǎn)基因牛; 重組人溶菌酶; 牛乳; 營養(yǎng)成分; 食用安全性

　　人溶菌酶( lysozyme) 是一種存在于人體正常體液及組織中的堿性多肽，由 130 個氨基酸組成，對生物體的自身防御起著重要作用[1]。人乳中溶菌酶的含量高、活性強，也是人乳不易敗壞的主要原因。人乳中溶菌酶含量約 0.5 mg /mL，比牛、綿羊和山羊乳含量高出 1 500～4 000 倍，破壞和溶解細(xì)菌的能力約為牛乳的 300 倍，是人乳中的重要抗菌因子，也是動物乳“人乳化”的主要研究對象。人乳中的溶菌酶可破壞大多數(shù)革蘭氏陽性菌和少量陰性菌的細(xì)胞壁[2-3]，有利于嬰兒腸道正常菌群的建立和提高抗病能力。隨著對奶制品消費需求的增加，奶制品的品質(zhì)也越來越受到人們的關(guān)注。利用乳腺生物反應(yīng)器的方法表達(dá)重組人溶菌酶，使生產(chǎn)出的奶含有高抑菌活性的溶菌酶，既有營養(yǎng)功能，又有藥用功能[4]。隨著對轉(zhuǎn)基因動物的研究越來越廣泛，人們越來越重視轉(zhuǎn)基因制品的安全性。筆者以先前成功獲得的轉(zhuǎn)人溶菌酶基因奶牛為研究對象，通過與普通奶牛( 非轉(zhuǎn)基因牛) 對照的方式，探明轉(zhuǎn)基因牛乳與普通牛乳的營養(yǎng)成分及代謝組差異，并對重組人溶菌酶進行了毒理學(xué)試驗，進一步探究重組人溶菌酶的安全性。

　　1 材料與方法

　　1.1 材料 乳樣采集自中國農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗基地的 1 頭轉(zhuǎn)人溶菌酶奶牛和 3 頭非轉(zhuǎn)基因奶牛。重組人溶菌酶由轉(zhuǎn)基因奶牛乳中純化得到。

　　1.2 方法

　　1.2.1 牛乳營養(yǎng)成分分析。牛乳營養(yǎng)成分分析方法見表 1。

　　1.2.2 牛乳代謝組。乳樣離心( 4 ℃，3 000 r/min，5 min) ，棄沉淀。上清液離心( 4 ℃，12 000 r/min，15 min) ，棄沉淀，重復(fù) 3 次。吸取 100 μL 上清液，加入新的 1.5 mL EP 管中，并加入 350 μL 預(yù)冷甲醇。加入 10 μL 核糖醇，漩渦 30 s，冰水浴 5 min，離心( 4 ℃，12 000 r/min，15 min) 。將上清液在真空壓縮器中干燥，將 80 μL 氧胺鹽試劑加入干燥后的代謝物中，攪拌混勻，在 80 ℃烘箱中孵育 30 min。加入100 μL BSTFA，70 ℃進行孵育 1.5 h，隨機順序上機檢測。結(jié)合數(shù)據(jù)庫 LECO-Fiehn-Rtx5，通過 ChromaTOF( v4.3x，LECO) 軟件對質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行分析。

　　1.2.3 重組人溶菌酶急性經(jīng)口毒性試驗。

　　1.2.3.1 大鼠急性經(jīng)口毒性試驗。依據(jù)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)急性經(jīng)口毒性試驗》( GB 15193.3—2014) 進行重組人溶菌酶的大鼠經(jīng)口毒性試驗。依據(jù)預(yù)試驗的結(jié)果并且以霍恩氏法進行試驗設(shè)計，共設(shè)計 4 個劑量組，劑量分別為2 150、4 640、 10 000 和 21 500 mg /kg。按照體重隨機二步法對大鼠進行分組，雌、雌大鼠各 2 組，每組各 10 只大鼠。

　　在灌胃之前，大鼠需要進行 16 h 禁食，飲水自由。重組溶菌酶灌胃大鼠時，需要分 2 次進行，間隔時間為 4 h，之后再進行 3 h 禁食，連續(xù)進行 14 d 的觀察。重組人溶菌酶灌胃大鼠之后，需要對大鼠的臨床情況進行觀察和記錄( 如中毒情況、死亡情況等) ，觀察終點為灌胃后第 14 天。觀察期間，及時對死亡大鼠進行尸體解剖及組織病理學(xué)檢查。試驗終點后，對所有試驗大鼠進行脫頸椎處死，并進行全身解剖進行組織病理學(xué)檢查。

　　試驗結(jié)束時統(tǒng)計不同性別大鼠的存活數(shù)量、中毒癥狀的嚴(yán)重程度和可逆性、死亡、存活及解剖檢查中各種病變的發(fā)生頻率。分別計算上述各因素的發(fā)生率和灌胃第 0、7、14 天的平均體重和標(biāo)準(zhǔn)差。

　　1.2.3.2 小鼠急性經(jīng)口毒性試驗。依據(jù)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)急性經(jīng)口毒性試驗》( GB 15193.3—2014) 進行重組人溶菌酶的小鼠經(jīng)口毒性試驗。依據(jù)預(yù)試驗結(jié)果并且以霍恩氏法進行試驗設(shè)計，共設(shè)計 4 個劑量組，劑量分別為4 640、10 000、 21 500 和 46 400 mg /kg。按照體重隨機二步法將小鼠進行分組，雌、雌小鼠各 2 組，每 2 組各 10 只小鼠。在灌胃之前，小鼠需要進行 6 h 禁食，飲水自由。4 640、10 000、21 500 mg /kg 劑量組一次性灌胃小鼠，46 400 mg /kg 劑量組分 2 次灌胃小鼠，間隔時間為 4 h，之后再進行 1 h 禁食，連續(xù)進行 14 d 的觀察。觀察、記錄和統(tǒng)計方法同“1.2.3.1”。

　　1.2.4 重組人溶菌酶模擬胃腸液消化穩(wěn)定性試驗。依據(jù)《轉(zhuǎn)基因生物及其產(chǎn)品食用安全性檢測模擬胃腸液外源蛋白質(zhì)消化穩(wěn)定性試驗方法》( 農(nóng)業(yè)部 869 號公告-2-2007) 進行試驗。

　　按照 19 ∶1( V/V) 的比例將模擬胃( 腸) 液與重組溶菌酶樣品溶液( 對照樣品或受試蛋白) 進行混合，并且進行快速旋渦振蕩混勻，在 37 ℃下進行水浴并準(zhǔn)確計時。分別在 0、15 s 和 2、30、60 min 時，迅速轉(zhuǎn)移 200 μL 反應(yīng)液至 1.5 mL 離心管 ( 含有碳酸氫鈉溶液) 中。再加蛋白上樣緩沖液 70 μL，進行 5 min 沸水浴，在室溫下冷卻，進行 SDS-PAGE 電泳，將電泳后的凝膠進行考馬斯藍(lán)染色，脫色，待條帶變清晰，取出凝膠并對圖像進行保存。分別用模擬的胃、腸液對樣品進行消化，消化后的蛋白進行電泳，然后進行蛋白印跡，并 保 存圖像。

　　2 結(jié)果與分析

　　2.1 牛乳營養(yǎng)成分分析 轉(zhuǎn)人溶菌酶牛乳營養(yǎng)成分測定主要包括乳常規(guī)、16 種氨基酸、25 種脂肪酸的測定。

　　2.1.1 乳常規(guī)。乳常規(guī)的測定包括乳中水分、乳糖、蛋白質(zhì)總量以及體細(xì)胞和細(xì)菌總數(shù)。比較轉(zhuǎn)人溶菌酶牛乳( 試驗組) 和非轉(zhuǎn)基因牛乳( CK) 的乳常規(guī)測定值，由表 2 可知，這 2 組的水分、乳糖、蛋白質(zhì)含量以及體細(xì)胞的數(shù)量均無明顯變化，而試驗組的脂肪含量低于 CK( P>0.05) ，其細(xì)菌總數(shù)則高于 CK( P>0.05) 。

　　2.1.2 乳中氨基酸。對轉(zhuǎn)人溶菌酶牛乳( 試驗組) 和非轉(zhuǎn)基因牛乳( CK) 的 16 種氨基酸進行測定，結(jié)果見圖 1。從圖 1 可見，這 16 種氨基酸除了脯氨酸( Proline) 、丙氨酸( Alanine) 含量略有差異外，其他氨基酸含量接近或者相同，這 16 種氨基酸含量在 2 組間總體上差異不顯著( P>0.05) 。

　　2.1.3 乳中脂肪酸。對轉(zhuǎn)人溶菌酶牛乳( 試驗組) 和非轉(zhuǎn)基因牛乳( CK) 的牛乳中飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸共 25 種脂肪酸進行測定，結(jié)果見圖 2。從圖 2 可以看出，除了飽和脂肪酸 C14 ∶0、C16 ∶0、C18 ∶0以及不飽和脂肪酸 C18 ∶ln9c 在 2 組之間存在差異，其他脂肪酸則在 2 組之間則無明顯變化，說明脂肪酸含量在 2 組間總體上差異不顯著( P>0.05) 。

　　2.2 轉(zhuǎn)人溶菌酶牛乳代謝組結(jié)果與分析 基于 GC-TOF- MS 平臺在轉(zhuǎn)人溶菌酶牛乳與非轉(zhuǎn)基因牛乳組( CK) 總共檢測出 472 種代謝物，對所有的代謝組進行主成分分析，從圖 3 發(fā)現(xiàn)，試驗組和 CK 并沒有明顯的聚類現(xiàn)象，且 2 組之間沒有顯著差異( P>0.05) 。

　　2.3 重組人溶菌酶急性經(jīng)口毒性試驗

　　2.3.1 大鼠急性經(jīng)口毒性試驗。給予大鼠重組人溶菌酶處理后，2 150 mg /kg 組和 4 640 mg /kg 組大鼠均未見明顯中毒癥狀，試驗結(jié)束時未見有死亡的大鼠。在 10 000 mg /kg 劑量組，大鼠在最后一次灌胃后出現(xiàn)活動減少和精神不適癥狀。共死亡 6 只大鼠，其中雌、雄各 3 只。在觀察終點，存活 4 只大鼠，其中雌、雄各 2 只。21 500 mg /kg 劑量組大鼠在第 1 次灌胃后出現(xiàn)活動減少、精神萎靡的癥狀，末次灌胃后 1 h 開始有死亡大鼠，24 h 內(nèi)全部死亡。觀察期間，對死亡大鼠進行大體解剖，主要觀察到胃發(fā)生腫脹，其他主要臟器未發(fā)現(xiàn)明顯異常。試驗結(jié)束時，對處死的大鼠進行解剖，未發(fā)生明顯的毒理學(xué)變化。

　　觀察期內(nèi)動物體重呈增長相。 至 觀 察 終 點 時， 10 000 mg /kg劑 量 組 雌、雄性大鼠死亡率均為 60%; 21 500 mg /kg劑量組大鼠全部死亡，死亡率 100%。經(jīng)統(tǒng)計，重組人溶菌酶的大鼠急性經(jīng)口毒性試驗的雌雄 LD50 均為9 260 mg /kg，95% MNDG 可 信 區(qū) 間 為 6 360 ～ 13 500 mg /kg [5]。

　　2.3.2 小鼠急性經(jīng)口毒性試驗。給予小鼠重組人溶菌酶處理后，4 640 mg /kg 劑量組未發(fā)現(xiàn)明顯中毒癥狀及死亡的小鼠; 10 000 mg /kg 劑量組小鼠出現(xiàn)活動減少、精神萎靡等癥狀，24 h 內(nèi)雌、雄小鼠各有 1 只死亡，試驗結(jié)束時，雌、雄小鼠各有 4 只存活。21 500 mg /kg 劑量組，小鼠出現(xiàn)活動減少、精神萎靡等癥狀，1 h 后出現(xiàn)死亡，在 24 h 內(nèi)所有受試小鼠出現(xiàn)死亡。46 400 mg /kg 劑量組，小鼠首次灌胃重組人溶菌酶后出現(xiàn)活動減少、精神萎靡等癥狀，1 h 后出現(xiàn)死亡，4 h 后最后一次灌胃重組人溶菌酶，在 24 h 內(nèi)所有受試小鼠死亡。觀察期間，小鼠尸體解剖觀察到胃腫脹，其他主要器官未發(fā)現(xiàn)明顯異常。試驗結(jié)束時，小鼠死亡后的尸體解剖未發(fā)現(xiàn)明顯的毒理學(xué)變化。

　　觀察 期 內(nèi) 動 物 體 重 呈 增 長 相。至 觀 察 終 點 時， 10 000 mg /kg劑量組，雌、雄小鼠各有 1 只死亡，死亡率均為 20%; 21 500 mg /kg 劑量組，小鼠全部死亡，死亡率 100%; 至觀察終點時 46 400 mg /kg 劑量組，小鼠全部死亡，死亡率 100%。經(jīng)過統(tǒng)計計算，重組人溶菌酶的小鼠急性經(jīng)口毒性雌 雄 LD50 為 12 600 mg /kg，95% 可 信 區(qū) 間 為 9 260 ～ 17 100 mg /kg。

　　2.4 模擬胃腸液消化穩(wěn)定性

　　2.4.1 模擬胃腸液試驗。SDS-PAGE 顯示( 圖 4) ，在模擬的胃液中重組人溶菌酶及其可見降解片段在 2～30 min 內(nèi)全部消化( 3～7 孔道) 。蛋白免疫印跡結(jié)果( 圖 5) 顯示，重組人溶菌酶及其可見降解片段在模擬胃液( 4～8 孔道) 中 2～30 min 內(nèi)全部消化。

　　2.4.2 重組人溶菌酶模擬腸液消化試驗 。SDS-PAGE 結(jié)果顯示( 圖 4) ，在模擬腸液中重組人溶菌酶及其可見降解片段在 0～15 s 內(nèi)全部消化( 11～15 孔道) 。蛋白免疫印跡結(jié)果顯示( 圖 6) ，重組人溶菌酶及其可見降解片段在模擬腸液( 4～8 孔道) 中 0～15 s 內(nèi)全部消化。

　　3 結(jié)論與討論

　　在乳常規(guī)方面，轉(zhuǎn)基因牛乳的水分、乳糖、蛋白質(zhì)含量和體細(xì)胞數(shù)等與非轉(zhuǎn)基因組無明顯變化，但脂肪含量試驗組低于 CK，菌落總數(shù)高于對照組; 轉(zhuǎn)基因牛乳中所測的 16 種氨基酸及 25 種脂肪酸含量在 2 組之間無明顯差異。在牛乳代謝組方面，轉(zhuǎn)人溶菌酶牛乳和非轉(zhuǎn)基因牛乳無明顯差異。

　　Laible 等[6]研究表明，牛乳的乳成分容易發(fā)生變化。楊鵬華等[7]關(guān)于人乳鐵蛋白基因?qū)εＨ槌煞钟绊懙难芯拷Y(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因牛乳與常乳在乳脂、總蛋白、乳糖和干物質(zhì)的含量上無明顯變化，且外源蛋白的表達(dá)水平穩(wěn)定。

　　毒理學(xué)研究決定是否能夠?qū)⑿滤帒?yīng)用于臨床，并提供有關(guān)藥物的毒性劑量和治療指數(shù)的信息。同時科學(xué)、道德和法規(guī)要求在將任何潛在的新藥供人類使用之前，必須在動物中研究其安全性以定義安全的人類劑量[8]。溶菌酶在醫(yī)藥、食品行業(yè)以及畜牧領(lǐng)域都有著比較廣泛的應(yīng)用[9]，而轉(zhuǎn)基因得到的重組人溶菌酶在投入應(yīng)用之前，則需要進行毒理學(xué)方面的試驗，為今后的應(yīng)用提供試驗支持。食品安全是指符合人體的營養(yǎng)需求，且不會對人體健康造成急性、亞慢性和慢性危害[10]。該研究通過大鼠和小鼠急性經(jīng)口毒性試驗，結(jié)果表明，重組人溶菌酶屬于實際無毒蛋白; 重組人溶菌酶模擬胃腸液消化穩(wěn)定性試驗表明，重組人溶菌酶在胃腸液中都可消化。

　　周興華[11]對轉(zhuǎn)雙反義分支酶基因大米的急性毒性試驗研究表明，轉(zhuǎn)基因大米的 LD50>21.50 g /kg，試驗期間，動物狀態(tài)良好，無死亡和異常現(xiàn)象。因此，轉(zhuǎn)雙反義分支酶基因大米屬無毒級別。

　　根據(jù)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)急性經(jīng)口毒性試驗》( GB 15193.3—2014) 急性毒性( LD50 ) 分級標(biāo)準(zhǔn)，大鼠和小鼠急性經(jīng)口毒性試驗表明，重組人溶菌酶是一種實際無毒蛋白。模擬胃腸液消化穩(wěn)定性試驗結(jié)果表明，重組人溶菌酶在模擬的胃液中可消化，在模擬的腸液中極易消化，初步說明重組人溶菌酶無潛在的致敏性。