江西龍虎山10種鐵皮石斛的品質測定及分析

　　摘 要：目的：為了分析龍虎山鐵皮石斛資源的品質，對 DNA 條形碼技術鑒定的 10 種鐵皮石斛莖葉的 4 種營養成分和 2 種重金屬元素的含量進行測定。方法：采用苯酚硫酸法測定多糖的含量;采用高效液相內標法測定甘露糖的含量;采用酸性染料比色法測定生物堿的含量;采用凱氏定氮法測定蛋白質的含量;采用原子熒光光譜法測定砷的含量;采用原子吸收分光光度法測定鎘的含量。并運用聚類分析對鐵皮石斛進行分類，運用主成分分析對鐵皮石斛品質進行綜合評價。 結果：成熟的鐵皮石斛中，莖、葉的多糖含量范圍分別為 35.09%~49.59%、6.88%~14.05%，莖、葉的甘露糖含量范圍分別為 16.19%~25.12%、11.10%~16.88%，莖、葉的生物堿含量范圍分別為 0.158‰~0.251‰、0.022‰~0.053‰，莖、葉的蛋白質含量范圍分別為 2.72%~4.38%、 12.73%~18.38%。鐵皮石斛砷、鎘含量最高值為 1.892 mg/kg、0.234 mg/kg。結論：生長環境對鐵皮石斛的營養成分有一定影響，成熟種植鐵皮石斛的多糖、甘露糖、生物堿、蛋白質含量顯著高于成熟野生鐵皮石斛，鐵皮石斛莖的多糖、甘露糖、生物堿含量高于葉，葉的蛋白質含量高于莖，且葉也具有一定含量的多糖和甘露糖，鐵皮石斛的葉具有一定的利用價值。野生與種植鐵皮石斛均無砷、鎘超標。主成分分析表明鐵皮石斛的 6 種測定成分可以用 2 種主成分(累積方差貢獻率為 98.443%)來表示，主成分分析綜合得分最高的為米斛。本研究為龍虎山鐵皮石斛的利用與開發提供了理論依據。

　　本文源自保鮮與加工 發表時間：2021-03-10 《保鮮與加工》雜志是由國家農產品保鮮工程技術研究中心主辦的全國唯一以農產品保鮮與加工為主要內容的技術類科技期刊，也是中國農產品保鮮工程協會、中國農學會貯藏加工分會、中國園藝學會采后科學技術分會會刊，2000年創刊。十年來，我們始終堅持辦刊宗旨，全面推行以質量為中心的辦刊機制，追蹤國際同類研究發展前沿，以市場為導向，主要設置了專家論壇、保鮮研究、加工研究、專題論述、技術指南、科技前沿、政策法規、行業資訊、科普沙龍等欄目，突出理論與實踐相結合，提高學術水平與科技普及技術指導兼顧的特色，每年按期發行期刊6期，共計3萬冊，遍及全國除港澳臺外的31個省市自治區，為我國農產品保鮮與加工行業的技術進步及其相關技術產品產業化開發和科技普及起到了積極的促進作用。

　　關鍵詞：鐵皮石斛;莖葉;品質測定與分析;聚類分析;主成分分析

　　鐵皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)具有良好的保健功能和藥用價值，被譽為“九大仙草之首”。鐵皮石斛中的多糖、甘露糖、生物堿、蛋白質等化學成分[1-2]，在抗腫瘤[3-5]、降血糖血壓[6]、抗衰老[7]、抗疲勞[8]、退熱止痛[9]、心血管系統[10]及胃腸道[11]等方面具有重要的作用。

　　多糖、甘露糖、生物堿、蛋白質含量是評價鐵皮石斛品質的重要因素。鐵皮石斛的藥效與多糖的含量有著密切的聯系[12]，《中國藥典 2020 年版》(一部)中規定多糖含量不得少于 25.0%。甘露糖是唯一在臨床上使用的糖質營養素，許多疾病正是由于缺乏甘露糖糖化作用中的酵素而導致的[13]。生物堿是中草藥中重要的有效成分之一，大多數生物堿具有復雜的環裝結構，具有顯著的生物活性。蛋白質在參與機體防御功能，催化代謝反應、調節物質代謝和生理活動等方面具有重要的作用。重金屬超標日益成為影響中草藥品質和食用安全性的重要因素[14-15]，與其他重金屬相比，砷和鎘遷移能力強，極易在中草藥體內累積[16-17]。

　　野生鐵皮石斛對生長環境要求非常苛刻，且由于人工長期采挖和自然環境的破壞，使得鐵皮石斛成為瀕危藥用植物，被列入中國植物紅皮書[18]。鐵皮石斛在種植三年后會有成熟的標志是“封頂”，莖桿頂端不再生長，整個植株顏色加深。莖是鐵皮石斛的傳統食用部位，葉常常被拋棄，若對鐵皮石斛的葉加以研究和開發，可以大大提高鐵皮石斛資源的利用率。

　　龍虎山地區氣候生態環境適合，是我國野生鐵皮石斛主要分布地區之一。目前針對龍虎山鐵皮石斛資源的系統研究還未有報道，本文選取 10 種通過 DNA 條形碼技術鑒定的龍虎山鐵皮石斛[19]，從而避免了重復測定同一品種，其中 4 種為野生品種經過人工種植 1~3 年的鐵皮石斛，6 種為成熟的野生鐵皮石斛(因無法判斷野生鐵皮石斛的生長年限，所以只采摘成熟的野生鐵皮石斛)，對鐵皮石斛莖和葉的 4 類主要有效成分(多糖、甘露糖、生物堿和蛋白質)含量和 2 種微量重金屬元素(砷和鎘)含量進行測定，并運用 SPSS 25 對試驗數據進行分析，為鐵皮石斛資源的綜合利用提供依據。

　　1 材料與方法

　　1.1 儀器

　　AFS-8220 型原子熒光光譜儀(吉天)，Agilent 1100 型高效液相色譜儀(賽析)，7230 型紫外分光光度計(渡揚)，微量凱氏定氮儀(歐萊博)，GGX-6A 原子吸收分光光度計(海光)，WFX-220A 原子吸收分光光度計(瑞利)。

　　1.2 藥材

　　DNA 條形碼技術鑒定的 10 種龍虎山鐵皮石斛，其中 6 種為成熟的龍虎山野生鐵皮石斛，編號分別為： DOKM-4 野生、DOKM-5 野生、DOKM-12 野生、DOKM-13 野生、DOKM-19 野生、DOKM-21 野生;4 種為種植 1~3 年的龍虎山鐵皮石斛，品種分別是：矮紅、米斛、青黑節、龍虎 1 號，其中種植三年的已成熟。

　　1.3 方法

　　多糖含量的測定采用苯酚硫酸法[20];甘露糖含量的測定采用高效液相內標法[21];生物堿含量的測定采用酸性染料比色法[22];蛋白質含量的測定采用凱氏定氮法[23];砷的測定采用原子熒光光譜法[24];鎘含量測定采用原子吸收分光光度法[25]。

　　1.4 數據處理

　　每組實驗重復測定 3 次，數據結果以平均值±標準偏差表示。采用 SPSS 25.0 軟件對數據進行統計分析，均值間比較采用 Duncan’s 法。

　　2 結果與分析

　　2.1 營養成分分析

　　2.1.1 成熟鐵皮石斛的營養成分分析

　　成熟的野生和種植鐵皮石斛的營養成分如表 1 所示。在成熟鐵皮石斛的營養成分中，多糖是其主要營養成分，成熟的種植鐵皮石斛莖的多糖含量在 35.09%~49.59%，莖的多糖含量都達到了《中國藥典 2020 年版》(一部)的規定要求：>25.00%，葉的多糖含量在 6.88%~14.05%，莖與葉的多糖含量最高都是米斛;甘露糖含量在 16.19%~25.12%，葉的甘露糖含量在 11.10%~16.88%，莖、葉甘露糖含量最高的分別是米斛和龍虎1 號;生物堿含量在 0.158‰~0.251‰，葉的生物堿含量則要低的很，含量在 0.022‰~0.053‰之間，莖、葉生物堿含量最高的分別是矮紅和龍虎 1 號。種植鐵皮石斛的生物堿含量要高于野生鐵皮石斛，這是由于人工種植的鐵皮石斛在栽培過程中會施加氮肥，豐富的氮素營養會促進含氮次生代謝產物生物堿的合成[26]。成熟的種植鐵皮石斛莖的蛋白質含量在 2.72%~4.38%，含量最高的是龍虎 1 號，但龍虎 1 號與其它三種鐵皮石斛之間沒有顯著性差異(P>0.05);葉的蛋白質含量高于莖，含量在 12.73%~18.38%之間，含量最高的是龍虎 1 號，與其它鐵皮石斛具有顯著性差異(P<0.05)。

　　2.1.2 不同種植年限鐵皮石斛的營養成分分析

　　種植鐵皮石斛在 1~3 年的營養成分含量見表 2，鐵皮石斛莖的多糖含量隨種植年限的增加而顯著增加(P <0.05)，而葉的多糖含量在不同年限中則無顯著性差異(P>0.05)，這是由于多糖在葉中通過光合作用生成，運輸并存儲至莖中。由于甘露糖是多種多糖的組成成分，因此莖的甘露糖含量變化規律與多糖相似，葉的甘露糖含量在第 2 年最高(P<0.05)。莖的生物堿含量隨種植年限的增加而顯著增加(P<0.05)，葉的生物堿含量在第 2 年最高(P<0.05)。莖和葉的蛋白質含量都隨種植年限的增加而增加，且都具有顯著性差異(P <0.05)。

　　2.1.3 鐵皮石斛的砷、鎘含量分析

　　砷和鎘是植物非必需重金屬元素，根據《中國藥典 2020 年版》(四部)中藥材砷和鎘的殘留限量指標為 ： As≤2.0 mg/kg，Cd≤1 mg/kg。砷和鎘殘留的超標，會對鐵皮石斛的食用性和藥用性會造成一定的威脅，因此，測定鐵皮石斛的砷、鎘含量對鐵皮石斛的食用安全性具有一定實際意義。

　　野生鐵皮石斛和種植 1~3 年鐵皮石斛的砷、鎘成分含量測定結果見表 3。測定結果顯示，鐵皮石斛莖、葉的砷含量范圍分別為 0.283~1.691 mg/kg、0.321~1.892 mg/kg;莖、葉的鎘含量范圍分別為 0.021~ 0.234 mg/kg、 0.013~0.165 mg/kg，10 種鐵皮石斛的莖葉中砷、鎘含量均無超標。種植鐵皮石斛莖、葉的砷、鎘含量逐年顯著增加(P<0.05)，這是由于種植鐵皮石斛在生長過程中會使用化肥和農藥，而化肥和農藥含有微量的重金屬元素。野生鐵皮石斛的砷、鎘含量顯著偏低(P<0.05)，總體上與種植一年的鐵皮石斛相差不大，這是由于野生鐵皮石斛的生長環境一般在深山老林中，人為的重金屬污染來源較少。

　　2.2 鐵皮石斛樣品中 6 種成分的主成分分析

　　2.2.1 聚類分析

　　為了更深層次的研究不同品種鐵皮石斛成分之間的關系，以多糖、甘露糖、生物堿、蛋白質、砷、鎘等 6 種成分的含量為變量，利用 SPSS 25 軟件對 10 種成熟鐵皮石斛的莖進行聚類分析，圖 1 為鐵皮石斛莖的成分的聚類分析。從聚類分析圖可以看出，當平方歐式距離為 10 時，10 種鐵皮石斛被分為 2 大類，第 I 大類包括 6 種野生鐵皮石斛，第 II 大類包括 4 種植鐵皮石斛，說明鐵皮石斛的成分含量差異跟生長環境有著密切的關系;當平方歐式距離為 5 時，10 種鐵皮石斛則被分為 3 大類，第 I 大類依然是 6 種野生鐵皮石斛，第 II 大類包括米斛和龍虎 1 號，第 III 大類包括矮紅和青黑節，說明在生長環境相同時，鐵皮石斛各品種之間的成分含量也具有一定的差異。聚類分析將組分含量相近的鐵皮石斛聚到一類，可以更看出鐵皮石斛品種間的成分異同，從而方便對鐵皮石斛的某一成分實現針對性提取與利用。

　　2.2.2 主成分篩選及貢獻率

　　由于鐵皮石斛樣品中各成分含量在量綱上存在較大差異，為了客觀保障分析結果的準確性，利用 SPSS.20 對原始實驗數據進行標準化處理后，再進行主成分分析，得到主成分特征值及貢獻率，如表 4 所示。提取到 2 個主成分因子(特征值>1)，λ1=3.941，λ2=1.965，累積方差貢獻率 98.443%，既包含了大部分成分信息，充分的說明這兩個主成分能夠代表鐵皮石斛 6 種成分含量的水平。

　　以 2 個主成分為坐標軸構建主成分平面，將樣本的變量通過降維的方式投影在二維平面上，以觀察鐵皮石斛樣本的整體成分分布情況和各變量對樣本分布的貢獻大小，結果見表 5，多糖、甘露糖和生物堿在第 1 主成分上有較高載荷，相關性強，第 1 主成分集中反映了鐵皮石斛的藥用營養成分含量的水平;蛋白質、砷和鎘在第 2 主成分上有較高載荷，相關性強，第二主成分反映了蛋白質與重金屬含量的水平。

　　2.2.3 主成分得分及綜合評分

　　用主成分因子矩陣的數據乘以以相應的方差的算術平方根，得到 2 組主成分的特征向量，將特征向量與各 成 分 標 準 化 后 的 數 據 相 乘 ， 可 得 到 鐵 皮 石 斛 的 各 主 成 分 得 分 ， 各 主 成 分 解 析 表 達 式 為 ： H1=0.477V1+0.488V2+0.482V3-0.387V4+0.200V5+0.335V6 和 H2= -0.220V1+0.141V2-0.195V3+0.450V4+0.646V5+0.523V6，H1、H2 分別是第 1、2 主成分得分，V1~V6 分別為多糖、甘露糖、生物堿、蛋白質、砷和鎘的標準化數據。

　　以每個主成分所對應的方差貢獻率為所占總主成分方差貢獻率的比值為權重，得到鐵皮石斛樣品的綜合評分表達式為：H0=0.667H1+0.333H2，主成分和排名結果見表 6，10 種鐵皮石斛樣品中屬米斛的綜合得分最高，DOKM-5 的綜合得分最低。

　　3 討論

　　10 種鐵皮石斛中營養成分及重金屬含量都存在顯著性差異，其中莖葉中多糖含量最高的都是米斛，莖葉中甘露糖含量最高的分別是米斛和龍虎 1 號，莖、葉中生物堿含量最高的分別是矮紅和龍虎 1 號，莖葉中蛋白質含量最高的都是龍虎 1 號，成熟的野生鐵皮石斛的砷、鎘含量均低于種植三年的鐵皮石斛。

　　從測定結果來看，成熟的鐵皮石斛各營養成分含量高于野生鐵皮石斛，且具有顯著性差異(P<0.05)，這說明種植環境與野生環境對鐵皮石斛的營養成分影響較大。這是由于野生鐵皮石斛的生長環境條件惡劣，養分相對貧乏，而人工種植采用栽培基質，環境適宜且養分及陽光充足，有利于有機物質的合成及積累。作為鐵皮石斛傳統食用部位的莖，多糖、甘露糖、生物堿等營養成分含量豐富;鐵皮石斛的葉往往沒有得到有效的利用，雖然鐵皮石斛葉的多糖、甘露糖、生物堿低于莖，但其葉中也含有豐富的多糖和甘露糖，且葉的蛋白質含量高于莖，表明鐵皮石斛的葉也具有藥用價值和食用價值，若對鐵皮石斛的葉加以開發和利用，可以提高鐵皮石斛資源的利用率。

　　目前針對龍虎山鐵皮石斛資源的系統研究還未有報道，本研究對龍虎山鐵皮石斛資源的研究相對比較全面和系統，本文選用 DNA 條形碼技術鑒定的龍虎山鐵皮石斛，對 6 種野生和 4 種不同種植年限的鐵皮石斛利用現代分析方法測定相關成分，比較分析鐵皮石斛的莖葉在不同生長環境、不同種植年限的多糖、甘露糖、生物堿、蛋白質、砷和鎘的含量，通過聚類分析法可將 10 種鐵皮石斛進行分類，不僅可以對 10 種鐵皮石斛的品質進行劃分，再運用聚類分析、主成分分析進行數據分析，不僅方便對某一成分進行特定研究，從而為龍虎山的鐵皮石斛資源的藥用價值、食用安全性和開發利用提供理論基礎。