醫學論文刊發淺析重組人生長激素的研究

　　生長激素從表面意思來說跟我們人體的生長有很大的關系，是由腺垂體分泌的蛋白質，生長激素的分泌還受性別、年齡、晝夜節律的影響，好多增高藥的研制，都是從我們的生長激素下手的，下面小編介紹一篇關于生長激素重組的醫學論文。

　　【摘 要】 目的 觀察重組人生長激素(recombinant human growth hormone，rhGH)對大鼠腦缺血/再灌注損傷后缺血側大腦皮質存活素(Survivin)和半胱氨酰天冬氨酸特異性蛋白酶?3 (Caspase?3)表達的影響。方法 采用大鼠局灶性腦缺血/再灌注損傷模型,將72只健康雄性SD大鼠,隨機分為假手術組、對照組和治療組。分別于模型制作成功后1、3、5、7 d處死大鼠,采用連續切片免疫組織化學技術分別檢測缺血側大腦皮質Survivin 和Caspase?3的表達。結果 治療組Survivin表達較對照組明顯增多,而Caspase?3表達較對照組顯著減少。結論 腦缺血/再灌注損傷早期應用rhGH可上調Survivin表達及下調Caspase?3表達,抑制神經元的凋亡。

　　【關鍵詞】 腦缺血/再灌注損傷;重組人生長激素;Survivin;Caspase?3;細胞凋亡

　　重組人生長激素(recombinant human growth hormone，rhGH)在1986年通過基因工程技術合成，與人生長激素(human growth hormone, hGH)結構相同，目前主要用于治療生長激素缺乏性侏儒癥、燒傷、抗炎及不育癥等。近年來,國內外研究表明,生長激素具有減輕大腦缺血缺氧引起的損傷,抑制細胞凋亡,促進細胞存活等作用[1?4],但機制還不十分清楚。目前,尚未有生長激素對腦缺血/再灌注損傷后Survivin、Caspase?3表達影響的報道。本實驗通過應用rhGH觀察大鼠腦缺血/再灌注損傷后缺血側大腦皮質Survivin、Caspase?3表達的變化,探討其神經保護作用的可能機制,為臨床治療探索新的方法及思路。

　　1 材料與方法

　　1.1 實驗動物和分組 健康雄性SD大鼠72只,體質量250～280 g,由鄭州大學實驗動物中心提供。術前禁食12 h,禁水4 h。隨機分為假手術組、對照組(腦缺血/再灌注+生理鹽水組)、治療組(腦缺血/再灌注+rhGH組)3組,每組24只。

　　1.2 主要試劑和藥物 重組人生長激素注射液由長春金賽藥業有限責任公司生產; Survivin多克隆抗體及Caspase?3多克隆抗體購自美國SANTA CRUZ生物技術公司。

　　1.3 大鼠腦缺血/再灌注模型的制備及處理 線栓法大鼠局灶性腦缺血/再灌注模型采用改良的Longa[5]線栓法,大腦中動脈(MCA)阻斷2 h后,將尼龍栓線拔出,實現再灌注。假手術組除不插線外,其余步驟與對照組和治療組相同。參照 Zea Longa 5級4分制評分標準[5]，評分為1～3分的實驗動物入選。治療組在腦缺血/再灌注模型成功后開始頸部皮下注射重組人生長激素0.1 U·kg?1· d?1,1次/24 h。對照組注射同樣劑量生理鹽水,注射時間與次數同治療組。

　　1.4 組織切片和免疫組化檢測 分別于腦缺血/再灌注后1、3、5、7 d處死大鼠,以4%多聚甲醛灌注固定,石蠟包埋和切片。常規脫蠟、水化,取缺血側大腦皮質,按試劑盒提供的實驗步驟進行操作,DAB顯色,光鏡下觀察,胞漿出現棕色顆粒為陽性著色。

　　1.5 免疫組化結果分析 在光鏡下觀察Survivin 和Caspase?3免疫反應的結果,并采用Biosens Digital Imaging System v1.6(上海山富科學儀器有限公司) 圖像分析系統進行圖像定量分析。Survivin 和Caspase?3免疫組化染色標記強度用灰度值表示,比較各組陽性區平均灰度值的差異。

　　1.6 統計學處理 所有數據采用SPSS 13.0軟件處理,各組數據以±s表示,組間比較采用單因素方差分析,用LSD?t法進行兩兩比較,檢驗水準α=0.05。

　　2 結果

　　2.1 大腦皮質Survivin表達的變化 假手術組大鼠腦組織中Survivin僅有少量表達,對照組1～3 d達到高峰,隨后逐漸降低,至7 d仍有較高水平的表達,較假手術組顯著升高;治療組較對照組顯著升高,差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

　　2.2 大腦皮質Caspase?3表達的變化 Caspase?3在假手術組少量表達,對照組1～3 d達到高峰,后開始下降,至7 d時仍高于假手術組;治療組較對照組顯著下降,差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。表1 各組Survivin表達的變化(陽性區平均灰度表示)注：與假手術組同一時間點比較,△P<0.05;與對照組同一時間點比較, ▲P<0.05　表2 各組Caspase?3表達的變化(陽性區平均灰度表示)注：與假手術組同一時間點比較,△P<0.05;與對照組同一時間點比較,▲P<0.05

　　3 討論

　　腦缺血/再灌注損傷是一種常見的、復雜的病理生理過程。有研究表明[6],腦缺血后隨著再灌注時間的延長,缺血側皮層凋亡細胞數量明顯增加,主要分布在梗死灶邊緣區,48 h凋亡細胞達到高峰,說明凋亡在腦缺血/再灌注損傷中起重要作用。半胱氨酰天冬氨酸特異性蛋白酶(cysteing aspartate specific protease, Caspase)特別是Caspase?3處于凋亡過程的下游階段,是凋亡過程中的關鍵蛋白酶,及時抑制凋亡級聯反應過程中的關鍵蛋白酶,挽救缺血半暗帶區尚未凋亡的神經元是腦血管疾病治療的關鍵。而Survivin是凋亡抑制蛋白家族的成員,是至今發現作用最強的凋亡抑制蛋白之一,既能抑制細胞凋亡,又能誘導調控神經細胞的有絲分裂及生長周期時相,促進神經細胞增殖和血管生成等[7?8]。

　　腦缺血/再灌注損傷能促使缺血側腦組織Survivin強烈持續高表達。我們實驗觀察到腦缺血/再灌注損傷后Survivin表達升高,1～3 d達到高峰,隨后逐漸降低,至7 d仍有較高水平的表達,提示Survivin在腦缺血/再灌注損傷早期即參與抗凋亡的復雜生理過程。應用rhGH干預后Survivin表達顯著升高,說明腦缺血/再灌注損傷早期應用rhGH,可以增加Survivin 的合成和分泌。同時發現,腦缺血/再灌注損傷后Caspase?3表達升高,至再灌注1～3 d達到高峰,隨后開始下降,至7 d時仍高于假手術組,結果與國內外報道一致,表明腦缺血/再灌注損傷與細胞凋亡存在密切的聯系,參與了腦缺血后神經元損傷的病理過程。有研究認為[9?10],生長激素可能通過NF?kappa B 介導的信號轉導途徑產生抗凋亡蛋白Bcl?2 和BAG?1,促進細胞存活。也有實驗發現[2],心肌缺血/再灌注24 h后生長激素組心肌細胞的凋亡以及凋亡相關基因Caspase?3、Cleaved Caspase?3蛋白陽性染色細胞數均明顯少于心肌缺血/再灌注組。我們研究發現應用rhGH干預后Caspase?3表達較對照組顯著下降,提示rhGH可能直接或間接通過抑制Caspase?3活性,抑制神經元的凋亡。另有研究表明[11],Survivin可能直接抑制Caspase?3和Caspase?7的活性,阻斷凋亡信號誘發的細胞凋亡,從而抑制細胞凋亡,發揮腦保護作用。

　　綜上所述,我們認為腦缺血/再灌注損傷早期應用rhGH治療,可上調Survivin表達，下調Caspase?3表達,抑制神經元凋亡,但其具體的信號轉導通道目前尚不清楚,有待進一步研究。

　　【參考文獻】

　　[1] Azcoitia I, Perez?Martin M, Salazar V, et al. Growth hormone prevents neuronal loss in the aged rat hippocampus[J].Neurobiology of Aging,2005,26(5):697?703.

　　[2] 黃瑞健，李萌，孫培吾.生長激素對大鼠心肌缺血/再灌注后心肌細胞凋亡及凋亡相關基因Caspase?3 Cleaned caspase?3蛋白表達的影響[J].中國急救醫學,2008,28(6):527?530.

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